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导 语

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化、肝癌进展的共同病理通路，其核心驱动事件为肝星状细胞（HSCs）的活化及细胞外基质（ECM）的过度沉积。干扰素刺激基因15（ISG15）是I型干扰素通路的关键下游效应分子，主要通过ISGylation（ISG化），一种类泛素化的翻译后修饰，共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上发挥调控作用。已知过度ISG化修饰可加剧血管紧张素II诱导的心肌纤维化，但该修饰在肝纤维化发生发展中的作用仍未明确。

“脂肪肝学苑”第98期特别推荐华中科技大学附属同济医院赵健萍教授团队，在Gut发表的一项基础研究“ISG15 deficiency in hepatic stellate cells promotes TGFβ2-induced liver fibrosis by counteracting CREB1 ISGylation”，该研究从HSCs激活的角度，首次揭示了ISG15/ISG化修饰作为肝纤维化负调控因子的全新机制。

全文地址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40819890/

01 研究方法

实验模型：采用野生型与HSC特异性ISG15敲除（ISG15 CKO）小鼠，分别经CCl₄、胆管结扎（BDL）或胆碱缺乏高脂饮食（CDAHFD）诱导实验性肝纤维化模型；同时使用原代小鼠HSC、人HSC系LX-2及肝硬化患者肝组织样本进行验证。

实验技术：结合单细胞RNA测序、bulk转录组测序、蛋白质组学、免疫共沉淀（Co-IP）、表面等离子体共振（SPR）、染色质免疫沉淀（ChIP）、免疫荧光染色及腺相关病毒（AAV）介导的基因回补等，系统解析分子机制。

02 研究结果

1.  纤维化肝脏中活化HSC的ISG15表达显著下调

单细胞测序及多种纤维化模型均显示，纤维化肝脏中ISG15 mRNA和蛋白水平降低，整体ISG化修饰程度减弱；原代HSC在体外自发活化过程中ISG15呈进行性下调，且肝硬化患者肝组织中ISG15⁺Desmin⁺双阳性细胞比例从非肝硬化的78.33%骤降至7.96%，提示ISG15下调与HSC活化及纤维化进展密切相关。

图1

2. SG15缺失直接驱动HSC活化、增殖与ECM沉积

HSC特异性敲除ISG15后，18月龄小鼠自发出现肝胶原沉积和纤维化相关基因上调；在CCl₄、BDL及CDAHFD模型中，ISG15 CKO小鼠肝损伤指标、胶原含量及α-SMA/Col1a1表达均显著高于对照。体外实验证实，敲除ISG15或削弱ISG化修饰（敲低UBE2L6）可增强HSC增殖并上调促纤维化标志物，而增强ISG化修饰（敲低USP18）则逆转此效应，表明细胞内ISG15通过ISG化修饰途径抑制HSC活化。

3. ISG15通过ISG化直接修饰CREB1，负向调控TGFβ2/Smad2促纤维化通路

蛋白组学发现，ISG15缺失的HSC中TGFβ2为上调最显著的炎症相关蛋白之一，且TGFβ1/β3无变化，提示该调控具有亚型特异性。WB与ELISA进一步证实，ISG15敲除或ISG化修饰减弱（敲低UBE2L6）可显著增加TGFβ2的表达与分泌，反之增强ISG化修饰（敲低USP18）则降低其水平，且Smad2磷酸化变化与TGFβ2表达趋势一致。功能上，TGFβ2 siRNA及体内中和抗体实验分别逆转了ISG15缺陷诱导的HSC活化与肝纤维化，证实该通路为下游关键效应轴。

随后，研究者发现ISG15缺陷在mRNA水平上调TGFβ2，荧光素酶报告实验证实ISG15负调控其启动子活性，提示调控发生于转录层面。在候选转录因子中，敲除ISG15不影响RFX1、SP1及CREB1总蛋白，但显著增加CREB1 Ser133磷酸化及核转位，ChIP实验亦显示CREB1与TGFβ2启动子结合增强；当突变ISG15 C端LRLRGG基序（ISG15AA）后，上述促进作用被逆转，证明该抑制作用依赖ISG化修饰。

图2

4. HSC中过表达ISG15或药理学抑制CREB1均可有效缓解CCl₄诱导的肝纤维化

研究者通过AAV8‑GFAP载体在HSCs中特异性过表达ISG15，发现CCl₄模型下ISG15 CKO小鼠的血清转氨酶、肝脏羟脯氨酸含量显著降低，组织学染色显示肝损伤、胶原沉积及炎症浸润均明显减轻，同时纤维化/炎症相关基因及α‑SMA/Col1a1蛋白表达下调，证实HSC特异性ISG15恢复具有保护效应。

在转化层面，因ISG15缺乏有效药理学调控手段，且TGFβ2广谱抑制存在安全性顾虑，研究者转向CREB1抑制剂666‑15。临床样本显示肝硬化患者肝内p‑CREB1表达升高并与α‑SMA⁺活化HSC共定位，提示该靶点的临床相关性。经666‑15处理后，ISG15 CKO小鼠的转氨酶、羟脯氨酸含量显著回落，组织学纤维化与炎症表型明显改善，α‑SMA及Col1a1表达同步下调。以上结果支持CREB1抑制可作为ISG15缺陷相关肝纤维化的潜在治疗策略。

图3

03 研究启示与思考

可借鉴之处：研究者的研究逻辑链条清晰：表型发现（ISG15下调）→功能验证（敲除/过表达）→下游信号通路（蛋白质组学→TGFβ2/SMAD2）→转录调控机制（CREB1结合TGFβ2启动子）→分子修饰机制（ISG15直接ISGylate CREB1 Lys304/305）。环环相扣，每一步都建立在前一步的探索上，逻辑严密，值得作为机制研究的范本学习。

局限性：ISG15ylation目前认为是一种类泛素化修饰，而研究者最终发现其可以影响p-CREB1的表达，这种ISG化修饰引起底物蛋白的磷酸化形式改变现象并非ISG15化修饰的常见作用，研究者缺乏这一现象的讨论或研究。

04 研究结论与未来研究方向

该研究首次揭示了ISG15/ISG化修饰在肝纤维化中的关键保护作用。机制上，I型干扰素信号下游转录因子IRF9在活化HSC中下调，导致ISG15表达降低；ISG15缺陷减少了对CREB1 Lys-304/305位点的ISG化修饰，增强p-CREB1活性和核转位，促进CREB1与TGFβ2启动子结合，激活TGFβ2/SMAD2信号，最终驱动HSC活化、增殖和ECM沉积，加速肝纤维化进展。恢复HSC中ISG15表达或药理学抑制CREB1活性，可有效缓解实验性小鼠肝纤维化进展。

未来研究可进一步验证CREB1抑制剂666-15在肝纤维化中的临床治疗潜力，明确其安全剂量范围和长期疗效。同时，在机制研究部分，可进一步探索ISG化修饰如何影响CREB1的磷酸化状态。

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